高效液相色谱的日常使用和维护

发布日期:2015-01-19 10:05:43 作者:Admin 来源:科仪 点击:统计中...

     高新科技与现代产业的迅猛发展,促进了以高效液相色谱(HPLC)为代表的复杂样品的分离分析和分离纯化仪器的飞速发展。HPLC以它定量分析结果准确、分析周期短、分析范围广、分析检测限低等优势,在食品添加剂、药物成分分析等多领域得到了广泛的应用。高效液相色谱仪是一种高端检测仪器,它精密快速,有效准确检测的同时就要求我们一定要严格正确使用仪器,定期科学有效地维护仪器,只有这样仪器才能长久持续有效使用。但是从目前实际使用情况看,与高效液相色谱仪的应用及产品技术升级的发展速度相比,其使用和维护则相对比较滞后,从而造成对仪器的滥用和对耗材不必要的浪费。主要原因是由于对于仪器使用操作者的培训侧重于仪器的初步使用,忽略了仪器的后续培训及维护操作学习;其实很多高效液相色谱都是国外进口仪器,英文版本软件对于大多数理工科毕业的仪器操作者也是一个障碍。笔者根据自己的工作经验,以岛津LC-20AT液相色谱仪为例,阐述液相色谱仪在使用时应注意的几个问题及日常使用后的仪器维护基本事项,并对仪器使用过程中容易遇到的问题进行分析,提出解决方法。 

1高效液相色谱仪的组成 

高效液相色谱仪主要是由输液系统、进样器、色谱柱、检测器和色谱软件数据处理系统组成。 

1.1输液系统 

输液系统主要包括溶液贮器、在线脱气装置、高压输液泵、梯度洗脱装置。

溶液贮器用于存放符合HPLC要求的流动相。在线脱气装置主要功能是流动相在进入柱子前排除气泡。高效液相色谱柱的填料颗粒较小,通过25mm的色谱柱受到的流动阻力很大,因此需要通过高压输液泵抽取流动相输送至色谱柱。 

高压泵按输液性能可分为恒压泵和恒流泵两种。按机械结构又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种,前两种为恒压泵,后两种为恒流泵。恒压泵可以输出稳定不变的压力。在一般的分析仪器中,由于系统阻力不变,恒压亦可达到恒流的效果。但是当系统阻力发生变化时,输入压力即使不变,流量却可随阻力而变化。恒流泵则无论系统阻力如何变化都可保证其流量基本不变。在色谱实际操作中,系统阻力可能随着运行时间的增加产生微小的改变,因此恒流泵比恒压泵更优越。然而在泵和柱系统所允许的最大压力下操作时,恒压泵较为安全方便。

梯度洗脱装置是采用两种及以上不谈性质的溶剂,在分离过程中按照一定的程序设定改变流动相组成的一种洗脱模式。通过流动相极性的变化来调整被分离样品的选择因子和保留时间,可以使柱系统具有最佳的选择性和最大的峰容量。梯度洗脱能够提高分析成分之间的分离度,缩短分析周期,降低最小检测限,提高分析精度。对于复杂混合物,特别是保留值相差较大的样品的分离,梯度洗脱是一种极为有效的分析方法。 

1.2进样器 

进样系统是将分析样品送入色谱柱的装置,分为手动、自动进样器两种。手动进样器配有20100μL的定量环。  

1.3色谱柱 

色谱柱以液体为流动相,以广义的固相为固定相来进行分析样品的分离工作,它是高效液相色谱仪的心脏,柱效能高、选择性好是对色谱柱的基本要求。色谱柱按照分离模式大致可以分为:正相色谱柱和反相色谱柱。

正相色谱柱通常以硅胶(Silica)、胺基团 (NH2,APS)和氰基团(CN,CPS)等极性官能团的)非极性化合物的分离,样品一般能溶于有机溶剂。

反相色谱柱通常以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相为填料;使用极性较强的流动相,通常为水缓冲液与甲醇、已腈等混合物;适用于大多数有机化合物,生物大、小分子,样品一般能溶于水。以C8C18反相色谱柱为代表。   

1.4检测器 

检测器、泵与色谱柱是组成HPLC的三大关键部件。检测器是将色谱柱分离出的样品的物理或者化学特性转换为可以测量的电信号,通过色谱图记录下来,由色谱图中的峰形状判断分离效果,依据标物物质、分析样品的色谱图中的出峰时间、峰面积分别对样品进行定性、定量分析。常用的检测器主要有紫外吸收检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、 荧光检测器(FD)。 

 

2、高效液相色谱仪的日常维护   

2.1高效液相色谱仪器的开机、关机注意事项。 

一切分析准备工作做好后,依次按顺序打开稳压电源、高压输液泵、柱温箱、检测器,待以上各部件自检结束后,打开连接仪器的电脑,启动工作软件。 

仪器分析工作结束后,关闭工作软件,再依次按顺序关闭检测器、柱温箱、高压输液泵。

2.2对流动相的要求 

液相色谱所用的流动相一般为低沸点有机溶剂与水或者缓冲溶液的混合物。为保证液相色谱仪器的正常使用,所有流动相必须是色谱级的,且经过过滤杂质、排除气泡后装入干净的流动相贮存瓶中待用。 

2.2.1流动相的物理性能要求 

       对分析物要有足够的溶解能力,以利于提高检验的灵敏度;流动相的黏度要小,以保证合适的柱降压;流动相的沸点要低,以利于制备分离时样品的回收; 

2.2.2流动相的温度 

       一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过60℃,以低于40℃为宜。温度过高会加速键合相水解和硅胶的溶解,从而使填料性质改变,柱塌陷,降低柱效。最低使用温度不超过0℃。 

2.2.3流动相的过滤 

       所有流动相在使用前都必须经过0.45μm(或0.22μm)的有机相/脂溶性和水相(水溶性)滤膜过滤,以除去杂质微粒。

2.2.4流动相的脱气 

       液相色谱所用到的流动相必须预先脱气,否则容易在系统内产生气泡,影响泵的工作, 影响基线的稳定性。此外,溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相反应。溶解氧能与某些有机溶剂(如甲醛、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物,提高背景吸收,会在梯度洗脱时造成基线漂移或形成鬼峰。 

常有的脱气方法有以下四种:

1 在线真空脱气法   把真空脱气装置串联到储液系统中,并结合膜过滤器,使流动相在进入输液泵前脱气,此法效果较好,尤其适用于多元溶剂体系。 

2 超声波脱气法  此法是实验室较常用的一种方法,将配置好的流动相连同容器一起放入超声波水浴中超声1530分钟。 

3 抽真空脱气法  使用微型真空泵,降压至0.050.07MPa即可出去溶解的气体。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化,故对于多元溶剂体系应该先预先脱气后再进行混合,以保证混合后的组分不变。 

2.3泵的维护  含有缓冲盐的流动相不能保留在泵内,尤其是停泵过夜或更长时间。分析结束后一定要先用纯水冲洗泵,然后再换合适溶剂冲洗(一般反相键合固定相,可以是甲醇或者甲醇和水溶液)。

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